НПК СКиФФ

Приложение
СЕКС БАРЬЕР

Новые гестагенные препараты для ветеринарии

О.А.Зейналов, В.А.Андрюшина, Д.А. Авданина
Центр "Биоинженерия" РАН

Среди многочисленных лекарственных средств, применяемых в медицине и ветеринарии, особое значение имеют прогестины (гестагены). Спектр использования этих препаратов несравнимо велик. В медицине их применяют для лечения недостаточности лютеиновой фазы менструального цикла и других прогестерондефицитных состояний, гиперпластических состояний эндометрия, для устранения угрозы прерывания беременности, а также для лечения гормонозависимых опухолей [1]. Достаточно широк и спектр использования гестагенов в ветеринарии, причем здесь они достаточно интенсивно используются как с лечебной целью (при нарушениях функции яичников, матки, расстройствах гипоталамо-гипофизарной системы, для поддержания беременности, предупреждения эмбриональной смертности, регламентации сроков родов и др.). Кроме того, с их помощью регулируют отдельные этапы воспроизводства животных [2]. В последнем случае используется свойство прогестагенов тормозить половую охоту и овуляцию, что позволяет применять их для синхронизации половых циклов у сельскохозяйственных животных, а у собак и кошек для подавления течки и охоты или смещения сроков их наступления. Благодаря синхронизации половых циклов гестагенами удается вызвать охоту у большей части коров в 7-дневный период, достичь высокой оплодотворяемости, значительно сократить сервис-период и, как следствие, повысить выход телят и молочную продуктивность [3]. Проблема коррекции половой функции домашних животных, в частности кошек и собак, также остается чрезвычайно важной в ветеринарии. Прежде всего, она диктуется необходимостью устранения у животных клинических проявлений одного из периодов (либидо) стадии полового цикла - пустовки у собак и стадии эструса у кошек, свидетельствующих об их готовности к спариванию и доставляющие немало хлопот их хозяевам. В этот период животные становятся агрессивными, плохо едят, рвутся на улицу, издают пронзительные крики, часто убегают из дома. Много хлопот доставляют ложная щенность и контактные половые заболевания. Для устранения этих проблем принципиально возможны два решения: это гормональная коррекция или стерилизация с кастрацией. Следует отметить , что оба метода используются хозяевами животных исключительно для собственного спокойствия. Оба метода влияют на метаболические процессы животного организма. Однако, преимуществом гормонального воздействия является его обратимость, в то время как кастрация и стерилизация носят необратимый характер, приводят к безвозвратной потере репродуктивной функции и оказывают постоянное давление на обменные процессы животного на всю оставшуюся жизнь.

В мировой ветеринарной практике для регуляции воспроизводительной функции животных широко используются синтетические производные 17α-гидроксипрогестерона, такие как его капронат, мегестрола ацетат, медроксипрогестерона ацетат, пролигестон [2]. Эти соединения либо сами по себе , либо в сочетании с эстрогенами или простагландинами стимулируют охоту у животных и повышают синхронность ее проявления, регулируют гипер- и гипо-функцию яичников, а также снижают половую активность особей обоего пола, при этом подавление половой цикличности носит обратимый характер. В настоящий момент существует множество препаратов, созданных на основе этих соединений в разных странах и в разное время. К сожалению, все они далеки от совершенства и имеют свои преимущества и недостатки. Общим достоинством этих препаратов является то, что все они, являясь простейшими модификациями природных прогестагенов и их метаболитов, находятся в тесном родстве с ними и, поэтому, достаточно безвредны и могут использоваться в качестве лекарственных средств при наличии высокой активности и отсутствии побочных эффектов. Общим недостатком большинства указанных соединений является кратковременность действия (кроме пролигестона) и необходимость использования в достаточно больших количествах и в течение длительного времени (5 – 10 дней до получения эффекта), что может привести к возникновению побочных эффектов, например различных метропатий. Так, например, медроксипрогестерон ацетат дают животным по 2-3 мг на кг веса животного, а при использовании в качестве средства для регуляции половой охоты мегестрола ацетата курсовая доза его составляет 30 мг (5-6 таблеток по 5 мг) для животных массой до 5 кг. Использование одного гестагена в столь значительных количествах далеко не безопасно и может привести к гормональному дисбалансу в организме животного. Особое место в ряду ветеринарных препаратов занимает пролигестон (дельвостерон), являющийся на настоящий момент одним из лучших препаратов. Благодаря оригинальной структуре действующего вещества ( наличие в его молекуле 14α,17α-пропилидендиокси-группы), это соединение депонируется в жировой клетчатке и оказывает стойкое и пролонгированное (5-6 месяцев) действие на репродуктивную систему животного. Пролигестон быстро снимает агрессивность и гиперсексуальность, улучшает аппетит и способствует увеличению веса животного, используют его и для лечения и профилактики ложной щенности и дерматитов. Однако, вследствие сложности структуры соединения, этот препарат труднодоступен и дорог. К недостаткам его можно отнести необходимость использования в виде инъекций.

Рис. 1. Прогестерон

Таким образом, исследования по поиску соединений, обладающих высокой активностью, лишенных побочных эффектов и обладающих пролонгированным действием является актуальной задачей. Гормоны относятся к веществам “однократного действия” [4] – сделав свое дело, они тем или иным способом дезактивируются в организме, превращаясь в метаболиты. Изменения структуры при модификации молекулы могут затруднить действие дезактивирующих систем организма и тем самым увеличить время, в течение которого гормональная структура будет выполнять свою роль. В соответствии с известным уже в настоящее время механизмом действия прогестерона в организме легко определить и пути модификации, которые должны быть направлены на блокаду основных центров метаболизма в молекуле для продления ее активной жизни [5]. Это защита или затруднение метаболизма по 6-му положению путем введения метильной группы или галоида при С6, или дополнительное введение в молекулу прогестерона Δ6-двойной связи, это введение заместителя в 17α-положение и удаление кислорода при С3, например, путем присоединения оксиацильной группы. Именно такие видоизменения претерпела молекула прогестерона при переходе к производным мепрегенола: блокированы все основные центры метаболизма путем введения Δ6-двойной связи, метильной группы при С6, окcиацильной группы при С17 и восстановлением кето –группы при С3. Вышеприведенные изменения молекулы прогестерона привели нас к получению эфиров мепрегенола, гестагенная активность которых значительно превышает таковую у прогестерона . Пути модификации молекулы прогестерона в соответствии с механизмом его действия представлены на рисунке1.

Цели исследования

Целью нашего исследования был поиск новых высокоактивных аналогов в ряду производных мепрегенола. Разработанный нами синтез этих соединений из стеринов растительного и животного происхождения cделал их достаточно доступными. Из литературных источников известно [6,7] , что пролонгация действия стероидных соединений может быть достигнута путем получения их сложных эфиров по присутствующим в стероидной молекуле гидроксильным группам, чаще всего при С3, С17 и С21. Эфиризация стероидных препаратов придает им важное свойство – замедление выделения собственно стероида в организме по мере прохождения гидролиза эфирных групп во времени, что обеспечивает длительное существование базового вещества в организме и пролонгацию его терапевтического действия. Нами был синтезирован целый ряд эфиров мепрегенола ацетата и изучены их биологические свойства. Пути модификации молекулы прогестерона в соответствии с механизмом его действия представлены на рис. 1.

Материалы и методы

Разработанный нами синтез сложных эфиров мепрегенолацетата из стеринов растительного и животного происхождения (фитостерины, холестерин) [9, 10, 11] сделал их достаточно доступными. Синтезированы новые соединения (рис. 2, табл. 1), имеющие нормальное и изо- строение эфирного заместителя при С3, а также с заместителями, содержащими ароматические кольца [12, 13, 14].

Рис. 2. Эфир мепрегенолацетата (амол)

Затем изучили их гестагенную и контрацептивную активности. Изучение гестагенной активности полученных соединений в сравнении с прогестероном методом Clauberg-McPhail на неполовозрелых кроликах-самках и контрацептивной активности в сочетании с этинилэстрадиолом на половозрелых белых крысах линии Вистар проведено в НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН (г. Санкт-Петербург). Согласно методу Clauberg-McPhail эстрогенподготовленным самкам кроликов в течение 5 дней ежедневно вводили испытуемые препараты в определенном диапазоне доз (5 доз – 5 кроликов на 1 дозу). Все подопытные животные получали изучаемые соединения в виде масляного раствора (растворитель- растительное масло) перорально ( в желудок с использованием зонда). Введение препаратов производили ежедневно в утренние часы. На следующий день после последнего введения препарата кроликов забивали. После вскрытия фрагмент одного рога матки брали для гистологической обработки. Срезы препаратов матки с толщиной 7 мкм исследовали на светооптическом уровне при увеличении х 12. Оценку гестагенной активности проводили по 4-х бальной шкале McPhail , принимая во внимание степень прегравидных изменений эндометрия. Для каждого фрагмента матки оценивали несколько срезов, после чего проводили статистическую обработку полученных в группе данных. Результаты опытов обрабатывали методом регрессионного анализа. Вычисления вели по уравнению регрессии у=а +blg х, где у- индекс McPhail , х-доза гестагена в мг/кг, а и b- коэффициенты регрессии. Биологическая активность соединений оценивалась по ЕД 50 , соответствующей индексу McPhail, равному 2. Относительную гестагенную активность вычисляли, принимая за единицу активность прогестерона.

Изучение контрацептивной активности проводили на половозрелых крысах самках линии Вистар массой тела 160 –180 г. стандартным методом: введением препаратов (гестаген в сочетании с эстрогеном в соотношении 0,8 мг/кг и 0,04 мг/кг соответственно из расчета на килограмм массы животного) энтерально через зонд в растворе растительного масла ежедневно в течение 14 дней. На третий день введения препаратов самок подсаживали к самцам. Ежедневно проводили цитологический анализ влагалищных мазков. День обнаружения сперматозоидов в мазке считали первым днем беременности. Покрытых самок отсаживали в отдельные клетки и завершали 14-дневный курс введения испытуемых веществ. В течение 20 дней у покрытых самок продолжали брать мазки с целью определения сохранения или прерывания беременности. На 20-21 день после покрытия всех животных подвергали эвтаназии. После вскрытия проводили ревизию полости матки на наличие плодов и мест имплантаций. Контрацептивную активность (КА) рассчитывали по формуле : КА(%)= (1-Бо Пк/По Бк)100, где Бо и Бк-число беременных крыс в опыте и контроле соответственно; По и Пк – число покрытых крыс в опыте и контроле соответственно. Самцов использовали для покрытия из раcчета 2 самца на 3-х самок. Покрытие в опытных и контрольной группах происходило в первые 4 дня после подсаживания самок к самцам. Данные по изучению биологической активности представлены в таблице 1.

Соединение

Контрацептивная активность в сочетании с этинилэстрадиолом

Относительная гестагенная активность по отношению к природному прогестерону (акт-ть прогестерона принята за 1)

Ацетат амола (ацетомепрегенол)

36,8

26

Пропионат амола

89

12,2

Бутаноат амола

80

в стадии изучения

Валерат амола

63,6

5,64

Энантат амола

50

в стадии изучения

Капронат амола

63,6

17,2

Гемисукцинат амола

100

11,7

Изовалерат амола

45,5

11,59

Никотинат амола

27,3

10,39

Изоникотинат амола

83,3

7,3

Фенилпропионат амола

67

10,5

Амол- 17- ацетат мепрегенола (17-ацетат 6-метилпрегна-4,6-диен-3β,17α-диол-20-она). Экспериментальное изучение биологической активности исследуемых эфиров установило наличие у всех эфиров гестагенной активности более высокой , чем у природного гормона- прогестерона, а в комбинации с этинилэтрадиолом все эфиры проявили выраженный контрацептивный эффект .Как видно из таблицы 1 величины как гестагенной, так и контрацептивной активностей у изученных эфиров в значительной мере различаются. Из сравнения величин гестагенной активности изучаемых эфиров можно сделать вывод о зависимости величины биологической активности от устойчивости эфирной связи к гидролизу, определяющейся характером заместителя при С3. Чем медленнее проходит гидролиз эфирной группы, тем выше его гестагенная активность. Кроме того, из сравнения величин контрацептивной и гестагенной активностей полученных эфиров видно, что в ряду эфиров мепрегенола ацетата нет прямой зависимости между гестагенной активностью и контрацептивным эффектом и даже, напротив, многие эфиры ,имеющие высокую гестагенную активность, проявляют низкий контрацептивный эффект, и наоборот. Так, например, наиболее высокоактивный гестаген диацетат мепрегенола (относительная гестагенная активность 26) имеет контрацептивный эффект в сочетании с этинилэстрадиолом –36,8% , в то время как пропионат амола при низкой гестагенной активности (12,2) проявлял высокий контрацептивный эффект (89%). Факт несовпадения в стероидных эфирах высокой гестагенной активности с величиной контрацептивного эффекта уже был отмечен ранее в литературе на других производных [15, 16]. По мнению авторов, механизм действия таких гестагенов определялся не торможением овуляции, а их влиянием на постовуляторные процессы. Это может быть связано с наличием у некоторых соединений какой-либо сопутствующей активности, способной повлиять на величину контрацептивного эффекта, например, антигонадотропной или антиандрогенной. Такое разобщение биологических свойств в изученном нами ряду может оказаться вполне полезным фактором, так как дает возможность использовать соединения с высоким гестагенным индексом в качестве лечебных средств в гинекологии и ветеринарии, а другие в качестве высокоактивных контрацептивных препаратов, не отягощенных гестагенным действием.

В экспериментах на кошках и собаках выявили, что под влиянием эфиров мепрегенола улучшается физическое состояние животных, снижается половое возбуждение, снимается агрессивность, облегчается содержание домашних животных, создаются оптимальные рабочие условия для служебных и охотничьих пород собак [12]. На фоне введения эфиров с первого по третий день в зависимости от вида и веса животного) быстро снимались признаки проявления половой охоты и наблюдалась стадия спокойствия. При этом наблюдался высокий процент контрацепции у вошедших в контакт животных. В опытах по подавлению полового возбуждения в качестве подопытных животных использовали кошек и собак. Результаты опытов приведены в таблице 2.

Условия и результаты опытов

Бутаноат амола

Гемисукцинат амола

Пропионат амола

Всего животных в опыте:

-

кошек

15

27

31

котов

3

10

11

сук

10

18

22

кобелей

7

8

Угнетение полового возбуждения на 1,5 – 2 мес.:

-

у кошек

10

22

27

котов

6

9

сук

9

16

19

кобелей

5

6

Неполное или временное подавление возбуждения:

-

у кошек

4

4

4

котов

2

2

1

сук

1

2

3

кобелей

1

1

Отсутствие эффекта:

-

у кошек

1

1

котов

1

2

1

сук

кобелей

1

1

В чем достигнут желаемый эффект, %:

-

у кошек

93

96,2

96,7

котов

66,7

80

90,9

сук

100

100

100

кобелей

85,7

87,5

Как следует из данных таблицы 2 производные мепрегенола ацетата позволяют получить высокий синхронизирующий эффект. Основные достоинства соединений этого ряда — их высокая активность при пероральном использовании (разовая доза составляет от 0,001 до 0,1мг/кг массы животного), отсутствие побочных андрогенного и гестагенного эффектов, свойственных гестагенам 19-норстероидного ряда, и полное отсутствие как специфической (аллергенность, мутагенность, тератогенность), так и острой токсичности (LD 25 значительно превышает дозу 2000 мг/кг МТ).

Выводы

1. Среди изученного ряда эфиров мепрегенола ацетата найдены высокоактивные гестагены и соединения с высоким контрацептивным эффектом, представляющие интерес для медицины и ветеринарии.

2. Результаты проведенных нами исследований по изучению биологической активности новых гестагенных препаратов свидетельствуют о перспективности их применения в области ветеринарии для решения практически важной проблемы — регуляции воспроизводства животных.

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1993 г. Т. 1. С. 690.

2. Карпов В.А. Акушерство и гинекология мелких домашних животных. М., 1990 г. с. 268 - 270.

3. Прокофьев М.И., Кадатский Г.М., сабиров Т.К. регуляция воспроизводительной функции у коров прогестагенами. Зоотехния, 1994 г. № 2. с. 21 - 24.

4. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Кортикостероиды. Природа, 1966 г. № 10. С. 40.

5. Гриненко Г.С., Клинский Ю.Д., кадатский Г.М. и соавт. Изучение новых прогестагенных препаратов для регуляции половой функции сельскохозяйственных животных. Гормональное животноводство. 1977 г. с. 146 - 161.

6. Шахтмейстер И.Я. Проблемы рационального использования наружных лекарственных средств глюкокортикоидной природы в педиатрической практике.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1993 г. Т. 1. с. 704 - 705.

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1993 г. Т. 1. с. 694.

9. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г. Способ получения стероидных эфиров: Пат. РФ № 2156255, Бюл. изобрет. № 26. 2000 г.

10. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г. Способ получения стероидных эфиров: Пат. РФ № 2091388, Бюл. изобрет. № 27. 2000 г.

11. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г. Способ получения стероидных эфиров: Пат. РФ № 2091019, Бюл. изобрет. № 27. 1997 г.

12. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г. и соавт. Универсальное средство для ингибирования репродукции позвоночных животных: Пат. РФ № 2101013, Бюл. изобрет. № 1. 1998 г.

13. Зейналов О.А., Андрюшина В.А., Скрябин К.Г. Средство для регуляции репродуктивной функции и половой активности позвоночных животных и способ регуляции репродуктивной функции и половой активности позвоночных животных: Пат. РФ № 2233586, Бюл. изобрет. № 22. 2002 г.

14. Зейналов О.А., Андрюшина В.А., Савинова Т.С. и соавт. эфиры мепрегенола ацетата: синтез и оценка биологического действия. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2004 г. № 2. с. 8 - 11.

15. Никитина Г.В., Савченко О.Н., Степанов М.Г. Гормональные свойства новых производных 17а-оксипрогестерона. Проблемы эндокринологии. 1987 г., № 3. с. 60 - 63.

16. Neuman F.,Elger W., Nishino I., steinbeck H., Arzneim. Forsch. Drug res., 1977 г. № 27. с. 296 - 318.