НПК СКиФФ

Приложение
СЕКС БАРЬЕР

Изучение спектра биологической активности нового стероидного эфира-17а-ацетокси-3b-(1-карбокси-пропокси)-6- метилпрегна-4,6-диен-20-онa) гемисукцината амола или мепрегенола ацетата водорастворимого

О.А. Зейналов, В.А. Андрюшина, Т.С. Савинова, Е.В. Попова, В.А. Золотарева, Л.М. Кокорина, К.Г. Скрябин.

В настоящее время в медицине и ветеринарии чаще всего используются структурные модификации природных стероидов, имеющие, как правило, более высокую активность и лишенные побочных эффектов. Важным путем модификации стероидов является получение их сложных эфиров по присутствующим в стероидной молекуле гидроксильным группам, чаще всего при С3, С17 и С21. Эфиризация стероидных препаратов придает им важное свойство – замедление выделения собственно стероида в организме по мере прохождения гидролиза эфирных групп во времени, что обеспечивает длительное существование базового вещества в организме и пролонгацию его терапевтического действия. Цель настоящей работы - изучение физико-химических свойств и спектра биологической активности нового стероидного эфира ряда ацетата мепрегенола -17a-ацетокси-3b-(1-карбокси-пропокси)-6-метилпрегна-4,6-диен-20-он (3-гемисукцинат амола) (Рис.1), полученного нами ранее [1]. Это соединение привлекло наше внимание по двум причинам:

  • во-первых, гемисукцинаты (полуэфиры янтарной кислоты) и их соли являются широко распространенной лекарственной формой использования стероидных препаратов; как правило она применяется в экстренных ситуациях, когда необходимо достичь быстрого эффекта, так как гемисукцинаты водорастворимы и могут быть использованы парэнтерально (внутривенно или внутримышечно);
  • во-вторых, при расщеплении гемисукцинаты будут поставлять в организм помимо базового стероида янтарную кислоту, являющуюся универсальным промежуточным метаболитом, образующемся при взаимопревращениях углеводов, белков и жиров в растительных и животных клетках. Установлено, что янтарная кислота при поступлении в живой организм оказывает мощное оздоровительное действие. В основе лечебно-профилактических свойств янтарной кислоты лежит модифицирующее влияние на процессы тканевого метаболизма – клеточное дыхание, ионный транспорт, синтез белков [4].
Гемисукцинат амола (или мепрегенола ацетат водорастворимый)

Рис. 1. Гемисукцинат амола (или мепрегенола ацетат водорастворимый)

Способ получения гемисукцината амола был описан нами ранее [1]. Соединение представляет собой кристаллический порошок белого цвета и может быть охарактеризовано следующими физико-химическими данными: - температура плавления 128 – 130 0С;

- удельное вращение -800 (С =1; хлороформ); - экстинкция 97320 (λ 242; метанол); -Масс-спектр: М+ 486 ПМР-спектр : 0,67 с (3H 19- CH3); 0,96 с (3H 18- CH3 ); 2,02с и 2,05с (по 3Н СОСН3 и ОСОСН3); 1,76 ш.с.(3Н 6-СН3); 2,66 сим.м.(4Н –СН2 –СН2-); 5,3- 5,5 м (3Н по 1Н м –О-СН ш.с. СН=С). Изучение спектра фармакологической активности гемисукцината амола проводилось в лаборатории фармакологии НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН. Были изучены следующие виды активности: специфическая гестагенная, мутагенность, аллергенность, острая токсичность, контрацептивная, а также влияние на овуляцию и на невынашивание беременности.

Материалы и методы

Для испытаний использовались животные из питомника «Рапполово» РАМН, содержавшиеся в регламентированных условиях вивария НИИАГ им. Д.О. Отта на стандартном рационе. Для изучения биологической активности применены следующие методы:

Гестагенная активность

Гестагенная активность гемисукцината амола изучалась при оральном и подкожном способах введения в сравнении с прогестероном методом Clauberg-McPhail на неполовозрелых кроликах-самках массой 700- 1000 г. Каждый из исследуемых гестагенов вводили подопытным животным в течение 5 дней после предварительной эстрогенной подготовки в соответствующем диапазоне доз, указанных в таблице 1. На следующий день после окончания введения гестагена под эфирным наркозом проводили эвтаназию животных и иссекали фрагмент матки для гистологического исследования. Согласно методике, определяли степень прегравидных изменений эндометрия, которую оценивали по 4-бальной шкале McPhail. Экспериментальные данные теста обработаны по уравнению регрессии: y=a +b lgx , где у –индекс McPhail, х-доза соединения (мг/кг), а и b – коэффициенты регрессии. Для стандарта (прогестерона) и исследуемого вещества (гемисукцината амола) вычисляли эффективную дозу ED50(данные в таблице 1), вызывающую 50%-ный фармакологический эффект, соответствующий индексу McPhail, равному 2.

Контрацептивная активность

Изучение контрацептивной активности гемисукцината амола проводили на половозрелых крысах самках линии Вистар массой тела 160 –180 г. стандартным методом: введением препаратов (гестаген в сочетании с эстрогеном в соотношении 0,8 мг/кг и 0,04 мг/кг соответственно из расчета на килограмм массы животного)энтерально через зонд в растворе растительного масла ежедневно в течение 14 дней. На третий день введения препаратов самок подсаживали к самцам. Ежедневно проводили цитологический анализ влагалищных мазков. День обнаружения сперматозоидов в мазке считали первым днем беременности. Покрытых самок отсаживали в отдельные клетки и завершали 14-дневный курс введения испытуемых веществ. В течение 20 дней у покрытых самок продолжали брать мазки с целью определения сохранения или прерывания беременности. На 20-21 день после покрытия всех животных подвергали эвтаназии. После вскрытия проводили ревизию полости матки на наличие плодов и мест имплантаций.
Контрацептивную активность (КА) рассчитывали по формуле :
КА(%)= (1-БоxПк/ПоxБк)x100,
где Бо и Бк -число беременных крыс в опыте и контроле соответственно;
По и Пк –число покрытых крыс в опыте и контроле соответственно.
В эксперименте было использовано 37 самок и 25 самцов крыс. Самцов использовали для покрытия из раcчета 2 самца на 3-х самок. Покрытие в опытных и контрольной группах происходило в первые 4 дня после подсаживания самок к самцам.

Мутагенность

Мутагенную активность субстанции гемисукцината изучали в тесте доминантных летальных мутаций у грызунов. Исследовано влияние препарата на генетический аппарат зародышевых клеток млекопитающих на основе анализа доминантных летальных мутаций после однократного введения внутрь препарата в дозе 10 мг/кг. Этот метод является единственным тестом, позволяющим учитывать мутагенные изменения в половых клетках млекопитающих. Опыты проводились на 270 самках мышей линии Г1: СВАхС5781/6. Проведено три серии опытов.

В первой серии опытов проводилось спаривание 15 самцов с 45 самками в течение первой недели после введения препарата (стадия зрелых сперматозоидов). Во второй серии опытов тех же самцов подсаживали к другим 45 интактным самкам через неделю после введения самцам препарата (стадия поздних сперматид) и в третьей серии – через две недели после введения препарата (стадия ранних, средних сперматид). Всего в опыте участвовало 30 самцов, 15 из которых получали оливковое масло (контрольный эксперимент), а 15 — препарат. Через 2 недели после середины периода спаривания отбирали беременных животных, умерщвляли их смещением шейных позвонков, вскрывали и подсчитывали число живых и мертвых эмбрионов.

Острая токсичность

Токсическое влияние гемисукцината амола на организм млекопитающих в острых условиях опыта изучалось на половозрелых животных двух видов: мышах линии «Balb» массой 18-26 г и крысах линии «Вистар» массой 180-220 г. Всего использовано 30 мышей и 24 крысы обоего пола. В контрольные и опытные группы входило по 6 животных (3 самки и 3 самца). Изучаемую субстанцию вводили животным однократно перорально с использованием зонда: мышам вводили в трех дозах 1000, 100 и 10 мг/кг, крысам –2000, 1000, 100 и 10 мг/кг. Животные контрольных групп перорально получали оливковое масло в адекватном объеме (0,5 мл). В течение 14 дней после введения препарата проводили наблюдение за животными: регистрировали динамику массы тела (1-й, 3-й, 7-й и 14-й день опыта), поведенческие реакции экспериментальных животных, двигательную активность, потребность в пище и воде, состояние шерстного покрова. В конце эксперимента всех животных вскрывали и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, определяли их массу. Органы с визуально наблюдаемой патологией подлежали гистологическому исследованию.

Аллергенность

Изучение аллергенного действия гемисукцината проводили по трем тестам:

  • оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок);
  • метод накожных аппликаций метод накожных аппликаций;
  • конъюктивальная проба.

Экспериментальные исследования проводились на двух видах животных – морских свинках и кроликах.

Влияние на овуляцию

Изучение влияния гемисукцината амола на овуляцию, индуцированную внутривенным введением ацетата меди, проводилось на 22 половозрелых кроликах-самках массой 2,5 -3 кг породы «шиншилла». Часть животных (7 крольчих) получала препарат в разовой дозе 0,25мг/кг орально с одновременным внутривенным введением ацетата меди. Животные второй подопытной группы (7 крольчих) получали препарат в дозе 0,25 мг/кг внутрь в течение 5 дней. Одновременно с последним введением препарата проводили индукцию овуляции и подсчитывали число проовулировавших фолликулов, которое определяет реактивность яичников. Полученные результаты сравнивали с показателями контрольной группы животных (8 крольчих), получавших в указанные сроки дистиллированную воду в том же объеме и раствор ацетата меди.

Гестагенная активность гемисукцината амола и ацетомепрегенола по сравнению с прогестероном в тесте Clauberg-McPhail

Рис. 2. Гестагенная активность гемисукцината амола и ацетомепрегенола по сравнению с прогестероном в тесте Clauberg-McPhail.

Влияние на сохранение беременности

Влияние гемисукцината амола на сохранение беременности изучено на овариэктомированных мышах, которым парентерально вводили препарат в дозе 0,5 мг/кг с 8-го по 12 день беременности.

Изучена также способность гемисукцината амола предупреждать прерывание беременности, вызываемое введением простагландина. Опыты были поставлены на 16 беременных мышах породы Бальбы массой 18-20г. С целью индукции прерывания беременности мышам на 16 день беременности вводили однократно внутрибрюшинно простагландин «энзапрост Ф» в дозе 25мкг/мышь. С целью предупреждения индуцированного выкидыша животным вводили изучаемый препарат подкожно в дозе 0,25 мг/кг на 14,15,16 дни беременности. Последняя инъекция совпадала с днем введения простагландина. Контрольные животные в те же сроки получали оливковое масло.

Результаты изучения биологической активности и их обсуждение

Относительную гестагенную активность вычисляли, принимая за единицу активность прогестерона. Результаты изучения гестагенной активности представлены на рисунке 2 в виде зависимости индекса McPhail от логарифма дозы.

Из рисунка видно, что в изученном диапазоне доз гемисукцинат амола значительно превосходит по активности прогестерон. Учитывая ED50, для гемисукцината была определена относительная гестагенная активность в 11,74 раза превышающая активность прогестерона. Относительная гестагенная активность ранее изученного [2] ацетомепрегенола при оральном введении в 27 раз превышает активность прогестерона. При подкожном введении ED50 для гемисукцината амола составила 0,0087 мг/кг, а относительная гестагенная активность в 31 раз превысила активность прогестерона.

Результаты эксперимента по изучению контрацептивной активности отражены в таблице 2.

Влияние эстрогенной компоненты определяли сравнением с эстрадиолом валерианатом. Как видно из таблицы композиция гемисукцината амола с этинилэстрадиолом проявляет большую контрацептивную активность (100% эффект) по сравнению с валерианатом эстрадиола. Ранее [3] на крысах была изучена контрацептивная активность ацетомепрегенола в комбинации с этинилэстрадиолом, которая в стандартных условиях составила 36%, а 90% эффекта достигала только при значительном увеличении количеств гестагена и эстрогена (3 мг/кг ацетомепрегенола и 0,06 мг/кг этинилэстрадиола). Таким образом, контрацептивная активность гемисукцината амола почти в 3 раза превышает активность ацетомепрегенола (100% против 36%), в то время как гестагенная активность ацетомепрегенола более чем в 2 раза выше таковой у гемисукцината (27% против 11,74%). Таким образом, выяснилось, что нет прямопропорциональной зависимости между гестагенной и контрацептивной активностями. В дальнейшей работе предполагается изучить соотношение гестагенной и контрацептивной активностей у других эфиров амола.

Совокупность данных, полученных при изучении мутагенности гемисукцината амола, позволяет сделать вывод, что препарат в использованной дозе не увеличивает спонтанного уровня доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей ни на одной из трех изученных стадий сперматогенеза. Было обнаружено некоторое снижение частоты спонтанных мутаций в подопытных группах по сравнению с контролем. Таким образом, показано, что препарат не оказывает мутагенного эффекта на хромосомный аппарат.

При изучении острой токсичности введение субстанции гемисукцината в максимальных дозах, превышающих терапевтическую в 20000 раз , не привело к гибели ни одного животного, признаков интоксикации не отмечалось.

Макроскопическое обследование внутренних органов патологии не выявило. При введении субстанции в дозе 10 мг/кг, превышающей терапевтическую в 100 раз, изменений в относительной массе органов не отмечалось. Чувствительными к действию высоких доз препарата были печень, селезенка, а также почки у самцов и щитовидная железа у самок в дозе 1000 мг/кг. На основании проведенных исследований по изучению острой токсичности гемисукцината амола можно утверждать, что его среднелетальная доза LD50 превышает 2000 мг/кг, а сама субстанция гемисукцината амола является практически безвредной.

Результаты изучения анафилактогенной активности субстанции гемисукцината показали, что тестируемое вещество не вызывает анафилактической реакции и шока ни у одной из морских свинок. Признаков беспокойства, одышки или судорог, наблюдаемых в случае развития анафилаксии, отмечено не было. Все животные остались живы. Контактного дерматита не выявлено. Поведенческие реакции, потребление воды и пищи остались в норме. При изучении аллергенного действия в тесте накожных аппликаций установлено, что испытуемая субстанция при ежедневном нанесении на эпилированный участок кожи местно-раздражающего действия на кожу не проявляет. Явлений гиперемии, отека, шелушения или зуда ни у одного подопытного животного не наблюдалось за весь период хронического эксперимента (4 недели). При постановке конъюктивальной пробы результаты опытов показали отсутствие раздражающего действия субстанции на слизистую глаза у кроликов. Таким образом, изучение аллергенного действия по трем тестам показало, что гемисукцинат амола не вызывает аллергических реакций в опытах на морских свинках и кроликах.

При изучении влияния гемисукцината амола на овуляцию было установлено, что однократное введение испытуемого вещества в дозе 0,25 мг/кг не вызывает изменений в количестве проовулировавших фолликулов. При 5-дневном оральном введении препарата в той же дозе число проовулировавших фолликулов достоверно снижалось ( с 12,3 плюс (минус) 0,6 фолликулов в контроле до 9,0 плюс (минус) 0,5 – в опыте), что свидетельствует об угнетении овуляторной функции у животных. Таким образом, гемисукцинат амола проявляет антиовуляторный эффект на самках кроликов.

Результаты экспериментальных исследований в тесте на сохранение беременности показали, что овариэктомированные мыши, получавшие гемисукцинат амола, все сохранили беременность, в то время как овариэктомия, сделанная на 8 день беременности в контрольной группе мышей привела к прерыванию беременности. Следовательно, гемисукцинат амола, проявляя гестагенное действие, способствует сохранению беременности.

В эксперименте по способности гемисукцината амола предупреждать прерывание беременности, вызываемое введением простагландина, установлено, что предварительное трехдневное введение гемисукцината амола вызвало блокаду эффекта простагландина: у двух беременных самок из 8 появилась угроза выкидыша, однако беременность у всех подопытных животных закончилась родами в физиологические сроки. Выкидышей не было, потомство было жизнеспособным. В контрольной группе животных, не получавших гестаген, через 4 – 6 часов после введения энзапроста появились признаки угрозы выкидыша у 100% животных (кровянистые выделения) с последующим прерыванием беременности. Таким образом, применение гемисукцината амола предупреждает невынашивание беременности.

Зараженность собак токсокарами в городской и сельской местности. Таблица 2.


Соединение

Способ введения

Число животных

Диапазон доз, мг/кг

Показатели кривой доза-эффект

-

ED50, мг/кг

-

-

-

a

b

Прогестерон

в/м

25

0,0125-1,0

2,84

1,47

0,27

Гемисукцинат амола

per os

20

0,004-0,25

3,53

0,93

0,023

Ацетомепрегенол

per os

20

0,008-0,4

3,96

1,003

0,01

Гемисукцинат амола

в/м

20

0,004-0,25

3,58

0,77

0,0087

Выводы

1. Изученный препарат гемисукцинат амола не обладает аллергенной, мутагенной активностями и практически безвреден (отсутствие острой токсичности).

2. Гемисукцинат амола проявляет высокую гестагенную активность, как при пероральном, так и при подкожном введении, значительно превышающую активность прогестерона, и способствует сохранению беременности, что позволяет рассматривать его как перспективный лекарственный препарат для применения в медицине и ветеринарии.

3. Гемисукцинат амола проявляет антиовуляторный эффект и оказывает стойкий контрацептивный эффект в сочетании с этинилэстрадиолом, что позволяет использовать его для регуляции половой активности и контрацепции.

4. Выявлено, что у гемисукцината амола нет прямой зависимости между величинами гестагенной и контрацептивной активностей: так в сравнении с ацетомепрегенолом он обладает большей контрацептивной активностью при меньшей гестагенной.

Литература

1. Андрюшина В.А., Савинова Т.С., Скрябин К.Г. Cпособ получения стероидных эфиров.// Бюлл.изобр. - 1997. №27// Пат. РФ №2091388;

2. Корхов В.В., Никитина Г.В. Фармакологическая активность некоторых производных прогестерона // Фармакология и токсикология.- 1978. - №1. C. 55 - 59.

3. Никитина Г.В., Корхов В.В., Гриненко Г.С., Кадатский Г.М. Контрацептивная активность и механизм действия сочетаний нового производного 17α-ацетоксипрогестерона и этинилэстрадиола//Фармакология и токсикология.- 1980. №3. С. 196 – 198.

4. Федоренко А. Янтарная кислота- целебная сила ХХI века. Москва, 2002.